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本试剂盒适用于从各种酵母样本中高效而温和地抽提可溶性总蛋白。提取过程简单方便，避免了重复性差的研磨法，超声波法或压榨法对酵母细胞的破坏，避免激烈的机械处理造成的氧化和热度升高对目的蛋白的破坏作用。

本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解细胞膜组份，包括细胞质膜、核膜和各种细胞器膜。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒的蛋白提取组份中不含有不可透析除去的去垢剂组份，不含SDS、Triton X-100、chaps等可能影响质谱实验的组份，最后得到的蛋白质样品经过透析或者脱盐处理后将不含有去垢剂、高浓度盐等影响，基本可以满足下游任意的蛋白质组学相关实验研究。

本产品的蛋白酶抑制剂混合物中不含AEBSF，可以避免由于AEBSF导致的质谱峰漂移，因此使用本产品提取的蛋白样品可以用于质谱(Mass Spectrometry,MS)检测和分析，蛋白质组学(proteomics)等相关研究。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白也可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

• 使用方便，从细胞、组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 提取过程简便快捷，将蛋白提取的时间缩短至30分钟～1小时
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含5种独立的蛋白酶抑制剂Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 试剂拆封后请尽快使用完！

• 仪器准备：
  离心机、振荡器、涡旋混匀器、移液器、冰箱、冰盒。
  
• 试剂准备：
  PBS缓冲液、蛋白定量试剂盒。
  
• 耗材准备：
  离心管、吸头、一次性手套。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离至管底部再开盖。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

• 提取液制备：
  将试剂C1和试剂C2混合，配成蛋白提取液C，充分混匀备用。
  每500μL酵母蛋白提取液C中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  注：
  ① 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ② 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需重新加入蛋白酶抑制剂。
  ③ 以下步骤使用的蛋白提取液为此步骤配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
  
• 取酵母培养物，在4℃，1000g条件下离心5～10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。
  
• 用冷PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  注：在1000g离心5分钟。
  
• 每100μL体积或100mg湿重酵母沉淀物中加入400μL酵母提取液A，混匀后，在30℃条件下保温15分钟。
  注：酵母数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
  
• 在1000×g条件下离心5～10分钟，移除上清，收集酵母沉淀。
  
• 每100μL体积酵母沉淀物中加入250～500μL酵母蛋白提取液B，充分混匀。
  注：
  ① 根据酵母细胞量调整提取液用量，一般加酵母体积的2～5倍均可。
  ② 按酵母菌体体积每100μL或100mg湿重菌体加入250～500μL提取液。
  
• 在37℃条件下于振荡60分钟～90分钟。
  注：
  ① 使用振荡器或摇床的较低转速，提取液能轻微摇晃即可。
  ② 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
  ③ 不同酵母样本需要的时间差异较大，根据下游细胞裂解的难易程度调整，如果下游试剂C较难裂解，裂解后沉淀没有明显减少，需要延长此步骤处理时间至2小时。
  
• 在4℃，2000×g条件下离心10分钟，弃上清，留沉淀。
  
• 在沉淀物中加入300～500μL冷的酵母蛋白提取液C，混匀后，在2～8℃条件下振荡30～45分钟。
  注:
  ① 试剂C处理后沉淀应明显减少，否则延长处理时间。
  ② 用振荡器或摇床的较低转速保持提取液轻微晃动即可。
  ③ 没有振荡器的话，在4℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
  
• 在4℃，14000×g条件下离心15分钟。
  
• 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到酵母总蛋白。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ① 建议使用BCA法进行蛋白定量。
  ② 蛋白样品-80℃存放一年没有问题，但要注意避免被蛋白酶和细菌污染。
  
• 将蛋白样品透析处理或者脱盐柱脱盐处理后用于下游实验。
  注：
  ① 蛋白样品中含有盐，需要脱盐处理后用于双向电泳。
  ② 经透析或脱盐离心柱处理的蛋白样品不含有去垢剂和高浓度盐。

• 蛋白浓度低？
  处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂B或C的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法，或者Bradford法。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。